よくある技術的なご質問

当社のLAL試薬に関連した「よくある技術的なご質問」のページです。
お客さまからよくいただくご質問をQ&A形式でまとめました。

なお、規制等に関するご回答には、当社独自の見解や解釈が含まれる可能性がありますので、
疑問が生じた場合は、通知文書やガイドラインの原文をご確認いただくとともに、必要に応じ当局にお問い合わせください。

最新のよくあるご質問

エンドトキシン試験法

• Q1-11医療機器のエンドトキシンはどのようにして測定すればよいですか？

  A1-11

  血液と接触する医療機器については、生物学的安全性評価項目の一つとして、発熱性を発熱性物質試験あるいはエンドトキシン試験により評価することが求められています11)。

  エンドトキシンの抽出温度および時間については、USP<161>6)では37℃で1時間以上を標準としていますが、厚生労働省の医療機器の生物学的安全性試験法ガイダンス11)では、エンドトキシン溶液を加熱処理すると活性が失われることがあることから、抽出は室温で行うことを基本としています。
  可能であれば、連続振とうや超音波処理を行って適切な時間抽出します。
  最適な抽出時間は材料の種類により異なります。
  抽出液としては、水（注射用蒸留水）で良好な回収率が得られる材料も存在しますが、プラスチック、金属、ハイドロキシアパタイトのほか、 天然医療材料では効率よくエンドトキシンを回収するために、キレート剤、界面活性剤、希酸、生物材料分解酵素等を含む様々な組成の抽出液が報告されています。

  第三者認証機関の認証を受ける医療機器については、認証の判断材料の一つとしてJISが使用されており、エンドトキシン抽出法およびエンドトキシン規格値が示されたJISが多数発行されています。
  これらは日本工業標準調査会のホームページで検索、閲覧が可能です。
  Q&A 1-20もご参照ください。

  更新日：2020/6/10
  掲載日：2019/4/1

• Q1-20プラスチック製または金属製の医療機器、医療材料の反応干渉因子試験（エンドトキシンの添加回収試験）はどのように行えばよいですか？

  A1-20

  通常、反応干渉因子試験（エンドトキシンの添加回収試験）は、医療機器に既知濃度のエンドトキシン標準溶液を塗布、乾燥させて行います。
  回収方法は、回収液に水あるいはこれにキレート剤または界面活性剤等を添加した溶液（血清タンパク質不含）を用いると安全かつ効果的です31)。
  さらに材料の特性を考慮し、超音波装置や振とう機等を用いて抽出処理を行う場合もあります。
  JIS記載の方法では、医療機器に汚染しているエンドトキシンを検知できない可能性が高く、回収液にキレート剤等を用いて、超音波処理を行う方法等が有効であるとの報告があります30)。
  抽出液のエンドトキシン濃度を所定の光学的定量法（比濁法または比色法）を用いて測定、算出します。
  Q&A 1-11もご参照ください。

  更新日：2020/6/10
  掲載日：2019/4/1

• Q1-21再生医療等製品のエンドトキシンはどのようにして測定すればよいですか？

  A1-21

  再生医療等製品（ヒト細胞加工製品）の品質及び安全性の確保についての厚生労働省医薬食品局長からの通知類の中で、安全性評価の一項目としてエンドトキシン試験の実施が求められており、以下のように記述されています12)。

  「試料中の夾雑物の影響を考慮して試験を実施すること。規格値は必ずしも実測値によらず、日本薬局方等に示されている最終製品の1回投与量を基にした安全域を考慮して設定すればよい。また、工程内管理試験として設定することも考えられるが、その場合には、バリデーションの結果を含めて基準等を設定し、その妥当性を説明すること。」

  なお、注射用医薬品のエンドトキシン規格値は、生体レベルでの発熱誘導能に基づいて設定されていますが、再生医療等製品の場合は、細胞増殖能や細胞分化能といった細胞への直接的な影響も考慮する必要があると言われています13)。

  エンドキシン試験の具体的実施方法のうち、検体としては、細胞そのものがエンドトキシン試験を妨害する可能性もあるため、培養上清など、製剤から細胞を除去したものを検体として用いてよいとしています14)。
  また、細胞以外の原料や工程資材、製造用水等のエンドトキシンレベルも適切に設定して管理することが、「再生医療等製品の無菌製造法に関する指針」42)では求められています。
  なお、日本薬局方の試験法に完全に準拠する必要はないとされており14)、生きた細胞を用いるために出荷判定が急がれる状況下では、事前に適切な評価がなされていれば保存検量線やCSEを使用することも可能であるとの研究結果も示されています15)。

  試験方法の設定は、規制当局と事前に十分協議されることをお勧めします。

  更新日：2020/06/10
  掲載日：2019/10/1

エンドトキシン測定装置・器具

• Q3-7EGリーダーSV-12の測定原理と特長を教えてください。

  A3-7

  EGリーダーSV-12は、少数検体を専用のLAL試薬エンドスペシー®ES-24Sセットを用いて、比色法カイネティック反応速度法でエンドトキシン測定するためのチューブリーダーです。
  付属の専用ソフトにより、インキュベーション、吸光度測定、測定結果の算出まで自動的に行います。

  掲載日：2019/10/1

• Q3-8エンドトキシン試験でデータインティグリティー（DI）対応が求められています。どのように対処すればよいのですか？

  A3-8

  弊社ではデータインティグリティー(DI)対応版のウェルリーダーアドバンス専用ソフトをご用意しています。

  詳細は当社Webサイト内でご案内しておりますので、以下よりカタログをご参照ください。

  • Software for Wellreader, DIエディション

  掲載日：2019/10/1

• Q3-9EGリーダーSV-12の機器更新推奨期間はどのくらいですか？

  A3-9

  「EGリーダーSV-12」は、製造元である株式会社サイニクスにより、更新推奨時期を納入後7年と設定されています。
  定期的に保守点検を実施しても、製造当初の性能を維持し続けることには限界がありますので、更新推奨時期を目途に早めの更新をご検討ください。なお、保守点検についてはQ&A3-5をご参照ください。
  

  詳細は当社Webサイト内でご案内しておりますので、以下よりご参照ください。

  • 長年ご使用頂いているEGリーダーSV-12の更新と定期的な保守点検のお願い
  • EGリーダーSV-12　更新と定期的な保守点検について

  掲載日：2019/10/1

１．エンドトキシン試験法

• Q1-1ゲル化法、比濁法、比色法はどのように使い分ければよいですか？

  A1-1

  ゲル化法は、通常試料溶液を2倍系列希釈し、陽性を示す最小エンドトキシン濃度から試料原液中のエンドトキシン濃度を求めるため、半定量法です。
  一方、比濁法および比色法は、試験ごとに検量線を作成するため、定量性に優れています。
  試験で求められる感度や定量範囲、試験の頻度や試料数、等により、試験法を選択します。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-2三極薬局方エンドトキシン試験法(BET)は完全に調和されていますか？

  A1-2

  BETの国際調和は、1999年に最初の調和合意がなされた以降、2003年に設置された日米EU医薬品規制調和国際会議(ICH) Q4B専門家委員会で各局方間の不一致部分の見直しが行われ、2009年に最終調和合意に至りました。
  これにより2011年4月以降、基本的には3局のBETは調和されています。
  

  ただし、各規制当局の政策上の相違により、以下の点が異なります。

  1. 米国薬局方(USP)と欧州薬局方(EP)では、使用するライセート試薬は、当局の規制に基づき製造されたものに限ると明記されていますが、日本薬局方(JP)にはこの記述はありません。
     したがってUSP, EPで試験を実施する際は、米国食品医薬品局(FDA)認可のライセート試薬を使用する必要があります。
  2. エンドトキシン標準品(CSE)の使用は、EPのガイドライン(5.1.10)5)とFDAのQ&A1)では認めるとの記述がありますが、日本では出荷試験での使用は認められていません。

  その後2013年には、薬局方テキストをICH地域内において相互利用するための評価および勧告に関するガイドライン(ICHQ4Bガイドライン)に基づき、エンドトキシン試験に関する事項別付属文書(Annex 14)が、厚生労働省2)、米国FDA3)、欧州医薬品庁4)より通知されました。

  なおAnnex 14では、三極薬局方のエンドトキシン標準品(RSE)は、世界保健機関(WHO)の国際エンドトキシン標準品を基準に評定されていることから、相互利用できるとしていますが、医薬品製造販売承認（申請）書においてエンドトキシン試験がどの薬局方に従うのかを記載する場合には、使用するRSEと薬局方とが合っている必要があります。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-3RSEの溶解前／溶解後の保存方法および使用期限を教えてください。

  A1-3

  各RSEの溶解前／溶解後の保存方法および使用期限は以下のとおりです。

  	溶解前	溶解後
  	保存温度	保存温度	使用期限
  JPRSE （日本薬局方エンドトキシン標準品）	1～8℃	1～8℃(禁・凍結)	14日以内
  USPRSE, Lot H0K354 （米国薬局方エンドトキシン標準品）	-25～-10℃	2～8℃(禁・凍結)	14日以内
  EPRSE, BRP Batch 5 （欧州薬局方エンドトキシン標準品）	-20℃±5℃	2～8℃	14日以内
  		-40℃以下(小分け後)	(記載なし)

  掲載日：2019/4/1

• Q1-4局方エンドトキシン試験法(BET)にControl Standard Endotoxin(CSE)を用いても構わないですか？

  A1-4

  日本薬局方では、出荷可否試験には必ずJPRSEを用いることが求められています。

  USPにはCSEについて記載はありませんが、米国FDAは、Q&A1)で、RSEの在庫量を保持するために、特定ロットのライセート試薬と組み合わせて適切に校正したCSEの使用を推奨しています。

  また、EPガイドライン5)でも、国際標準品やEPRSEで標定（校正）されていれば使用して構わないとしています。
  Q&A 1-2もご参照ください。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-5工程内試験および最終出荷試験時のサンプリング計画はどのように立てればよいですか？

  A1-5

  本質問は米国FDAのQ&Aで最初に扱われています1)。
  米国と日本でGMPの要求事項は基本的に変わりませんので、以下その回答を引用します。

  GMPでは、科学的に妥当なサンプリング計画を含めた管理体制の構築が求められています。
  エンドトキシン試験用のサンプリング計画について、USP37)には記載はありません。
  サンプリング計画を立てるためには、原料、中間生成物、および最終製品が汚染される可能性について、製造工程の一貫性、工程内保持時間が与える影響、エンドトキシン除去工程、最終製品のエンドトキシン規格値等を含む製造設計を基に考慮する必要があります。サンプリング計画は更新すべきものと認識し、当初は最大限の範囲から出発し、製造工程でのエンドトキシン混入防止に対する信頼が獲得された後は改定します1)。

  USPでは、医療機器のエンドトキシン試験と発熱性物質試験についてのチャプター6)において、サンプルサイズは、ロットサイズ、管理レベル、統計学考察およびそれまでの実績に基づき決定すべきとしています。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-6液体製品にエンドトキシンを添加すると、保存期間とともにその含量が低下する場合があります。製品製造後、何日以内にエンドトキシン試験を実施しなければならないですか？

  A1-6

  通常、製剤中に混入したエンドトキシンは安定なため、製造後その値は変化しません。
  しかし、添加剤として界面活性剤とキレート剤（ポリソルベート20とクエン酸など）を含有する生物薬品の場合には、製剤原液に添加したエンドトキシンが、薬局方エンドトキシン試験法(BET) で検出できない、あるいは経時的に値が低下する現象が報告されていて、この現象はLow endotoxin recovery (LER) と呼ばれています。

  この現象が問題となるのは、BETで規格内となった製品がウサギ発熱性試験で陽性になることがあるためです。
  この現象は、保存温度と保存時間に依存するとともに、添加するエンドトキシンの種類にも依存します。
  RSEやCSEのような精製エンドトキシン(LPS)標品で起こりやすく、天然由来で未精製のエンドトキシンの場合は起こりにくいとされています7)。

  米国FDAでは、添加剤に界面活性剤とキレート剤が含有される場合には、エンドトキシン添加後1週間の安定性試験(hold time study) の結果を、申請時に提出することを求めており、LER現象が認められる場合は、出荷試験としてウサギ発熱性試験の実施を求めています8)。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-7試料溶液のpHはエンドトキシン試験に影響しますか？ライセート試液と試料のpHは、試験の都度、測定しなければならないですか？試料溶液のpHを調整する場合はどうすればよいですか？

  A1-7

  ライセート試液の至適pHは通例6～8であり、試料溶液との混液のpHが6～8であることを確認した後は、必ずしも試験の都度pHを測定する必要はありません。
  ただし、どのような場合にpHを測定して記録するかは手順化する必要があります。

  混液のpHが範囲外の場合は、酸、塩基、または適当な緩衝液でpHを調整します。
  市販のHCl原液やNaOHの固体は、エンドトキシンをほとんど含有しませんが、エンドトキシン汚染の無い容器や器具を用いて調製し、調製後エンドトキシン含量を確認する必要があります。

  また、pH調整処理により、エンドトキシンが損失等しないことを保証するために、予めエンドトキシンを添加した試料溶液を中和処理し、その回収率が50～200%の範囲内であることを確認する必要があります。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-8エンドトキシン標準品や被検溶液は、希釈時などになぜ激しく撹拌する必要がありますか？

  A1-8

  エンドトキシン(LPS)分子は、両親媒性のため、標準品溶液や試料溶液中では高分子量ミセルあるいは凝集体を形成します。
  一方、ライセート試薬のエンドトキシンとの反応性は、ミセルの大きさによって変化します。
  溶解時や希釈時に十分撹拌することは、ミセルを十分に分散させるとともに、ガラス等の容器への吸着を防ぐことにより、一定の分子サイズのミセルを形成し、ライセート試薬との反応性を安定化するために有効と考えられています。

  なお、局方エンドトキシン標準品の溶解時、希釈前、希釈時の撹拌方法については、添付文書や局方に以下のように記載されています。

  f

  	撹拌方法
  	溶解時	希釈前	希釈時
  JPRSE a)	Vortexミキサーで5分間激しく	3-5分間激しく	1分間激しく
  USPRSE, Lot H0K354 b)	Vortexミキサーで間欠的に合計30分間	3分間激しく	30秒以上
  EPRSE, BRP Batch 5 c)	-Vortexミキサーで間欠的に合計30分間	3分間激しく	30秒以上

  a) 添付文書および(一財)医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団主催日局エンドトキシン試験法に関する技術研修会資料より

  b) 国際調和以前のUSPの記載より

  c) Ph. Eur. Reference Standard – Leafletより

  掲載日：2019/4/1

• Q1-9エンドトキシン試験はクリーンベンチやラミナーフローフード内で行う必要がありますか？

  A1-9

  エンドトキシンは、環境中に普遍的に存在します。
  その汚染を避けるため、エンドトキシン試験は、エンドトキシンフリーの器具を用いて、無菌操作を行う必要があります。

  ただし、空中落下菌や浮遊菌による影響は、清浄な試験環境下であれば通常無視できますので、人の出入りが少なく、落下菌や浮遊菌の少ない清潔な室内で、清潔な作業着を着用し、手をよく洗浄した後、試験を実施すれば構いません。
  出入り口付近やHEPAフィルターの付いていない通常の空調の吹出し口付近は避けてください。
  高感度測定が必要で、また環境からの汚染のリスクが無視できない場合は、クリーンベンチやラミナーフローフード内で操作した方が安全です。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-10水に不溶な油性試料やリポソーム製剤中のエンドキシンはどのようにして測定すればよいですか？

  A1-10

  水不溶性の油性物質に対しては、水抽出が有効な場合があります。
  例えば、ごま油中のエンドトキシンは添加した水の層に分配され回収できます9)。
  油性試料に比色法ライセート試薬を直接添加し、水浴中で振とうしながら反応させ、ジアゾ試薬で反応停止した後、遠心して水相部分を分取し比色定量することもできます。

  リポソーム製剤中のエンドトキシン測定には、SDSやCHAPSなどの界面活性剤処理が有効と言われています10)が、低濃度でエンドトキシン分子の解離会合に影響するため、慎重な予備検討が必要です。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-11医療機器のエンドトキシンはどのようにして測定すればよいですか？

  A1-11

  血液と接触する医療機器については、生物学的安全性評価項目の一つとして、発熱性を発熱性物質試験あるいはエンドトキシン試験により評価することが求められています11)。

  エンドトキシンの抽出温度および時間については、USP<161>6)では37℃で1時間以上を標準としていますが、厚生労働省の医療機器の生物学的安全性試験法ガイダンス11)では、エンドトキシン溶液を加熱処理すると活性が失われることがあることから、抽出は室温で行うことを基本としています。
  可能であれば、連続振とうや超音波処理を行って適切な時間抽出します。
  最適な抽出時間は材料の種類により異なります。
  抽出液としては、水（注射用蒸留水）で良好な回収率が得られる材料も存在しますが、プラスチック、金属、ハイドロキシアパタイトのほか、天然医療材料では効率よくエンドトキシンを回収するために、キレート剤、界面活性剤、希酸、生物材料分解酵素等を含む様々な組成の抽出液が報告されています。

  第三者認証機関の認証を受ける医療機器については、認証の判断材料の一つとしてJISが使用されており、エンドトキシン抽出法およびエンドトキシン規格値が示されたJISが多数発行されています。
  これらは日本工業標準調査会のホームページで検索、閲覧が可能です。 Q&A 1-20もご参照ください。

  更新日：2020/6/10
  掲載日：2019/4/1

• Q1-12新規医薬品や医療機器のエンドトキシン規格値はどのようにして定めればよいですか？

  A1-12

  日局参考情報では、注射剤のエンドトキシン規格値は、下記式で設定されるとしています16)。

  エンドトキシン規格値=K/M

  （Kは、発熱を誘起すると言われる体重1kg当たりのエンドトキシンの量(EU/kg)で、投与経路により異なる。Mは体重1kg当たり1回に投与される注射剤の最大量である。ただし、注射剤が頻回又は持続的に投与される場合は、1時間以内投与される注射剤の最大総量。）

  ただし、エンドトキシン規格値設定にあたっては、安全マージンの確保と薬剤の発熱物質増強作用の有無確認に十分留意する必要があります17)。実際の増強作用の確認方法については文献17に記されていますので参考としてください。

  また、新規医薬品のエンドトキシン規格値の設定は、ゲル化法、比色法、比濁法の3法すべての試験結果に基づく必要があるとされています16)。

  なお、医薬品原薬(API) のエンドトキシン規格値は、製剤の規格値をそのまま適用することはできません。
  賦形剤等の添加剤、溶媒、容器等に由来する可能性のある最大エンドトキシンレベルを求め、それを製剤の規格値から差し引いて原薬のエンドトキシン規格値を設定する必要があります。
  各成分の最大エンドトキシンレベルは、理論的考察（例：乾熱滅菌処理や洗浄済みか）および過去の測定値に基づき設定します18), 36)。

  医療機器のエンドトキシン規格値は、米国FDAのQ&Aによると、その用途と接触対象（例：血液、心血管系、脳脊髄液、鞘内投与経路、永久移植医療機器、皮下移植した医療機器）に依存します1)。
  FDA推奨の溶出／抽出液量は、通常の大きさの場合、試験対象10単位それぞれに40 mLであり、この抽出量に従うと、心血管系およびリンパ系に直接または間接的に接触する場合の製品の限度値は、0.5 EU/mLまたは20 EU／単位です。
  脳脊髄液に接触する場合の限度値は、0.06 EU/mLまたは2.15 EU／単位です。
  上記以外に、抽出液量からエンドトキシン限度値を決定する計算式がUSP <161>6)に示されています。

  FDAは、同一製造業者の同型医療機器の複数個を同一術部に対して同一手術法で用いたり移植したりする場合は、通常一般的にその手術に機器1単位を適用するときのエンドトキシン限度値を満たすことを求めています1)。
  このことは、限度値は1個当たりの値（すなわち20 EU）を1処置に使用する最大機器数で割った値でなければならないことを意味します。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-13発熱性物質試験とエンドトキシン試験の特異性を教えてください。

  A1-13

  発熱性物質試験法は、発熱性物質の有無をウサギに検体溶液を静注して調べる方法です。
  エンドトキシン試験法との基本的な相違は、エンドトキシン以外の発熱性物質も検出しうる点にあります。
  注射剤を汚染する可能性のある外因性発熱性物質としては、エンドトキシンのほかに、ペプチドグリカン、グラム陽性菌などによって産生される外毒素、ウイルス、病原性真菌などが挙げられます。

  しかし注射剤製造の上で最も汚染の可能性の高い発熱性物質は、至る所に存在し、かつ耐熱性の高いエンドトキシンです。
  外毒素やウイルスなどは熱に対する抵抗性が低く、加熱滅菌された製剤では失活します。
  またペプチドグリカンは耐熱性を示しますが、その発熱活性はエンドトキシンの数千分の一です19)。

  このように、エンドトキシン以外の発熱性物質によって注射剤が発熱惹起量を超えて汚染される可能性はきわめて低いと考えられます。
  したがって実質的に、エンドトキシン試験陰性で発熱物質試験陽性のものは無いと言うことになります。

  一方、エンドトキシン試験陽性で、発熱性陰性の物質については、(1→3)-β-D-グルカンが以前から指摘されてきましたが、現在では(1→3)-β-D-グルカンに反応しない特異性の高い試薬（当社エンドスペシーなど）が市販されています。
  (1→3)-β-D-グルカン以外で、発熱性が無くリムルス反応陽性の物質が無いかどうかも問題となりますが、現時点では構造が明確になっているものの報告はないようです。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-14ゲル化法で使用する反応用試験管は専用品でないとだめですか？口径が同じであれば使用可能ですか？

  A1-14

  ゲル化反応は試験管の材質（ほう珪酸、ソーダライム等）に影響を受けますので、メーカー推奨の製品をお使いください。
  当社のPyrotube（パイロテル用試験管）は10ｘ75mmのソーダライム（フリントガラス）製です。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-15エンドトキシン試験を行うために必要なものは何ですか？

  A1-15

  エンドトキシン試験には、ライセート試薬のほか、エンドトキシン標準品、反応容器（専用試験管やマイクロプレート）、希釈用試験管、チップ、測定機器、恒温槽などが必要です。

  器具は、エンドトキシンが検出されないこと、エンドトキシン試験に対する干渉作用がないことが確認されたものを用いる必要があります。

  ゲル化法、比濁法、比色法によって使用する試薬や器具、機器が異なりますので、詳しくは当社ホームページ掲載の下記カタログにある「エンドトキシン試験法に必要な試薬および器具」をご参照ください。

  • エンドトキシン測定用試薬 6th Edition(PDF:7,175KB)
  • 第十八改正日本薬局方における エンドトキシン試験法（標準操作法）(PDF:8,144KB)

  掲載日： 2019/04/01

• Q1-16希釈操作を行うとき、プラスチックで行なってよいですか？ガラス器具でないとだめですか？

  A1-16

  検体やエンドトキシン標準溶液の希釈用の容器としては、乾熱滅菌処理により容易にエンドトキシンフリーにできることからガラス容器が広く用いられています。

  ポリプロピレン製など一部のプラスチック容器には、エンドトキシンを吸着したり、リムルス反応を阻害したりする物質を溶出するものがあることが報告されていますので、プラスチック容器を使用する場合は、エンドトキシン汚染だけではなく、吸着や反応妨害のないものを用いる必要があります。

  ガラス容器も、ガラスの材質の違い、劣化（風化）の進行度、洗剤の残存などにより、エンドトキシンの吸着や反応干渉が見られる場合がありますので、エンドトキシン試験にはライセート試薬メーカー販売のガラス試験管の使用を強くおすすめします。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-17Control Standard Endotoxin(CSE)の力価は、なぜ特定ロットのライセート試薬で標定した力価のみが有効なのですか？

  A1-17

  このことについては、1987年のFDAガイドラインにおいて、CSEの力価は、ライセート試薬のロットごとに、USP標準エンドトキシンとCSEの一つのロットを同時に試験し、CSEの相対力価を評定する必要があるとされています20)。

  この要求は、生物原料であるライセート試薬のロットごとに成分が微妙に異なり、それが経験上認められる、CSEのRSEに対する相対力価の違いに影響していると考えたためと思われます。

  また、使用者が自ら試験を行う必要はなく、LAL試薬製造者が実施、作成した試験成績書(Certificate of Analysis) を使用できるとしています。

  本ガイドラインは、2011年7月12日付で取り下げられましたが、その後2012年6月に出されたQ&A1)において、FDAはCSEの使用を引き続き推奨しています。

  なお、CSEの使用可否についてはQ&A 1-4をご参照ください。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-18局方エンドトキシン試験法において、保存検量線の使用は認められていますか？

  A1-18

  国際調和された局方エンドトキシン試験法では、保存検量線および製品検量線の使用については、何ら言及していません。

  メーカーあるいはユーザーが作成した保存検量線を使用した試験法の適格性確認およびバリデーションを実施し、その妥当性が立証できれば、最終製品の出荷可否判定にも認められる可能性はあります。

  実際、院内製造PET薬剤のエンドトキシン測定21)や、人工透析用透析液中エンドトキシンの測定22)において、保存検量線の使用が検討され、測定者の教育訓練や測定装置の面で、よく管理された条件下においては、その妥当性が確認されています。

  なお、1987年のFDAガイドライン20)には、一定の条件下で保存検量線の使用を認める記載がありましたが、2011年に本ガイドラインは取り下げられています。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-19医薬品のエンドトキシン試験法を設定する場合は、ゲル化法、比濁法、比色法の3法の試験結果に基づく必要があるとされているが、なぜ1法のみの試験成績では有効とされないのでしょうか？

  A1-19

  新規医薬品の承認申請におけるエンドトキシン規格値の設定には、ゲル化法、比濁法および比色法についての反応干渉因子試験成績および3法による実測データを添付資料に記載する必要があります23)。
  これは3法が精度を含めて同等でないにもかかわらず、エンドトキシン規格値とともに設定に使用したエンドトキシン試験法を一般的には記載しないことから、いずれの試験法でもエンドトキシン規格値を満たすことが求められるためです24)。

  なお、エンドトキシン規格値の設定については、Q&A 1-12をご参照ください。

  掲載日：2019/4/1

• Q1-20プラスチック製または金属製の医療機器、医療材料の反応干渉因子試験（エンドトキシンの添加回収試験）はどのように行えばよいですか？

  A1-20

  通常、反応干渉因子試験（エンドトキシンの添加回収試験）は、医療機器に既知濃度のエンドトキシン標準溶液を塗布、乾燥させて行います。
  回収方法は、回収液に水あるいはこれにキレート剤または界面活性剤等を添加した溶液（血清タンパク質不含）を用いると安全かつ効果的です31)。
  さらに材料の特性を考慮し、超音波装置や振とう機等を用いて抽出処理を行う場合もあります。
  IS記載の方法では、医療機器に汚染しているエンドトキシンを検知できない可能性が高く、回収液にキレート剤等を用いて、超音波処理を行う方法等が有効であるとの報告があります30)。
  抽出液のエンドトキシン濃度を所定の光学的定量法（比濁法または比色法）を用いて測定、算出します。

  なお、JIS記載の方法では、医療機器に汚染しているエンドトキシンを検知できない可能性が高く、回収液にキレート剤等を用いて、超音波処理を行う方法等が有効であるとの報告があります30)。
  Q&A 1-11もご参照ください。

  更新日：2020/6/10
  掲載日：2019/4/1

• Q1-21再生医療等製品のエンドトキシンはどのようにして測定すればよいですか？

  A1-21

  再生医療等製品（ヒト細胞加工製品）の品質及び安全性の確保についての厚生労働省医薬食品局長からの通知類の中で、安全性評価の一項目としてエンドトキシン試験の実施が求められており、以下のように記述されています12)。

  「試料中の夾雑物の影響を考慮して試験を実施すること。規格値は必ずしも実測値によらず、日本薬局方等に示されている最終製品の1回投与量を基にした安全域を考慮して設定すればよい。また、工程内管理試験として設定することも考えられるが、その場合には、バリデーションの結果を含めて基準等を設定し、その妥当性を説明すること。」

  なお、注射用医薬品のエンドトキシン規格値は、生体レベルでの発熱誘導能に基づいて設定されていますが、再生医療等製品の場合は、細胞増殖能や細胞分化能といった細胞への直接的な影響も考慮する必要があると言われています13)。

  エンドキシン試験の具体的実施方法のうち、検体としては、細胞そのものがエンドトキシン試験を妨害する可能性もあるため、培養上清など、製剤から細胞を除去したものを検体として用いてよいとしています14)。
  また、細胞以外の原料や工程資材、製造用水等のエンドトキシンレベルも適切に設定して管理することが、「再生医療等製品の無菌製造法に関する指針」42)では求められています。
  なお、日本薬局方の試験法に完全に準拠する必要はないとされており14)、生きた細胞を用いるために出荷判定が急がれる状況下では、事前に適切な評価がなされていれば保存検量線やCSEを使用することも可能であるとの研究結果も示されています15)。

  試験方法の設定は、規制当局と事前に十分協議されることをお勧めします。

  更新日：2020/6/10
  掲載日：2019/10/1

• Q1-22試験結果が規格外（OOS）となった場合には、どのように対処すべきでしょうか？

  A1-22

  米国FDAが医薬品製造全般について規格外試験結果が得られた場合の調査についてのガイダンス38)を発表しています。
  これを参照したうえでUSP<1085>Guidelines on the Endotoxin Test39)においては、エンドトキシン試験におけるOOS発生時の調査方法ならびに再試験の条件について、以下のことが述べられています。

  なぜ規格外の結果が得られたかについて、広範な調査を行い、理由が明確にならない限り、その試験結果は無効とすることはできません。 試験結果が無効となるのは、システム適合性パラメータ（陰性対照、陽性製品対象、検量線直線性）が不適で、測定が正しく実施されなかった場合です。真のOOSは、測定が有効な場合に発生したものを言います。

  調査の第一段階は、データの正確性の調査であり、検体のサンプリング法、その調製法、測定時のパラメータ、計算、記録において異常や誤りがなかったかを調査します。
  試験結果を無効にできる理由が発見できない場合は、OOSは有効となり、製品が規格外であり、製造工程に異常があったことが推定されます。

  その場合、次の段階では、エンドトキシン含量に影響を与える可能性のある全ての製造工程・活動を調査します。

  掲載日：2019/10/1

• Q1-23日局の記載では、4.2.1. 操作法において、「表4.01－2に従い、A，B，C及びD液を調製し、これらの4種の液を一組として試験を2回行う。」35)となっていますが、これはA，B，C及びD液を1組調製して反応させる試験を2回独立して行う必要があるのでしょうか。

  A1-23

  以下のことから判断して、A，B，C及びD液を2組（2本ずつ）調製してドライバスに一度にかけて同時に試験しても構いません。

  日局エンドトキシン試験法では、4つの表で、ゲル化法における「試験の回数」と光学的定量法の「試験管又はウェルの数」との用語を使い分けていますが、エンドトキシン試験法に関するICH国際調和文書40)やUSP, EPではいずれも「number of replicates」と表現されています。

  また、廣川書店の日本薬局方解説書では、表4.01－2に関する注に以下の記載があります。「2回の試験は同時に行ってもよい。ただし、A, B, C, D, 4種の溶液を1組とした試験であることに留意する必要がある。」41)

  掲載日：2019/10/1

• Q1-24エンドトキシン測定値が変動するのですが、どのような要因が考えられますか？

  A1-24

  エンドトキシン測定値が変動する要因としては、検体中のエンドトキシンが不安定な場合（添加剤として界面活性剤とキレート剤を含有する生物薬品の場合に見られるLER現象（Q&A1-6参照）等）、各種要因によるエンドトキシン汚染（空中浮遊微粒子・菌、器具の汚染、汚染物の接触等による）がある場合、エンドトキシンがプラスチック製の保存容器やチップに吸着する場合、測定器具から反応影響物質が溶出される場合、検体溶液や標準液の撹拌が不十分であったり、ピペッティング誤差が大きかったりなど測定手技に問題がある場合、(1→3)-β-D-グルカンにも反応するライセート試薬を用いて(1→3)-β-D-グルカンが混在している検体を測定する場合など、いろいろな可能性が考えられます。原因を注意深く探り、変動要因を除くようにしてください。

  掲載日：2019/10/1

2. エンドトキシン測定用試薬

• Q2-1溶解したライセート試薬の保存方法は？いつまで使用できますか？

  A2-1

  溶解したライセート試薬（ライセート試液）の保存可能期間は、製品によって以下のように異なります。
  それぞれの添付文書にも明記されていますので、ご確認ください。

  	製品名	冷蔵保存 （2～8℃）	冷凍保存 （-20℃以下）
  ゲル化法試薬	パイロテルマルチテスト	24時間	3ヶ月
  	パイロテルシングルテスト	用時、検体で溶解	－
  比濁法試薬	パイロテル-T	24時間	3ヶ月
  比色法試薬	パイロクロム	8時間	不可
  	エンドスペシー トキシカラー	用時調製	不可
  	パイロスマートネクストジェン	用時調製	不可

  掲載日：2019/4/1

• Q2-2局方エンドトキシン試験法の分析法バリデーションはどのようにして行えばよいですか？

  A2-2

  エンドトキシン試験法など、医薬品中に存在する不純物の量を測定する試験法、すなわち純度試験法（局方ではタイプII）で評価すべき分析法パラメータとしては、医薬品の規制に関する国際調和会議（ICH）のテキスト25, 26)ならびにそれに基づく局方参考情報では、定量試験は以下に示すものを評価する必要があるとされています。

  • 真度
  • 精度（併行精度、室内再現精度）
  • 特異性
  • 定量限界
  • 直線性
  • 範囲

  このうち真度と直線性は、通常実施されるエンドトキシン試験の予備試験の反応干渉因子試験と検量線の信頼性確認試験で評価されます。
  特異性については、メーカーから提供されるライセート試薬の特異性についての情報でたりると思われます。
  したがって分析法バリデーションとしては、さらに精度（併行精度と室内再現精度）と定量限界の評価が求められていると解釈できます。
  各パラメータの評価順序に定めはありませんが、一例として、定量限界と範囲→直線性→真度→併行精度と室内再現精度の順があげられます。

  バリデーション実施上の注意点としては、試料の均一性を確保すること、試料中のエンドトキシンの安定性を事前に確認しておくことなどがあげられます。

  当社執筆の記事27)も参考にしてください。

  掲載日：2019/4/1

• Q2-3ゲル化試薬が表示感度で固まらない場合があるが、どんな原因が考えられますか？

  A2-3

  以下の可能性が考えられますので、対策が必要です。

  • 反応用試験管は、メーカー指定のもの（材質およびサイズ）をお使いください。
  • 検体の希釈やゲル化試薬の溶解に使用するエンドトキシン試験用水は、メーカー指定のものをお使いください。
  • 反応中の振動はゲル形成を妨害しますので、撹拌機付の水浴などは避け、反応管の外径と合った穴を有し、また熱伝導率の高いドライブロックヒータなどを用いてください。
  • 判定時、反応管を180°転倒する際に、激しく動かすとゲルが壊れることがあります。静かに操作してください。
  • 反応中、温度が37±1℃に保たれていることを確認してください。

  掲載日：2019/4/1

• Q2-4ライセート試薬などエンドトキシン試験に必要な試薬類および器具等の試験成績書(Certificate of Analysis/ Certificate of Compliance)はどのように入手すればよいですか？

  A2-4

  当社では、各製品のロットごとに、メーカーでの試験結果を示した試験成績書(Certificate of Analysis)、あるいはメーカーでの出荷規格を満たすことを宣言した適合性証明書(Certificate of Compliance)を提供しています。

  これらの書類は、当社ウェブサイトの「試験成績書検索」画面に製品コード番号、製品ロット番号、有効期限などを入力することにより、ダウンロードすることができます。

  詳しい操作法は検索画面の記述をご参照ください。

  掲載日：2019/4/1

• Q2-5ライセート試薬を使用したエンドトキシン試験において、どのような物質が反応を妨害しますか？

  A2-5

  リムルス反応の妨害物質としては、以下の物質等が知られています。

  A	セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター タンパク質変性剤 有機溶媒　など
  B	キレート剤 界面活性剤 鉄、アルミニウム、アルミニウム、クロム、ガリウム等の金属イオン　など

  このような妨害は、ゲル化法に限定されず、Aは主にライセート試薬の酵素系に作用し、タンパク質の加水分解、限定水解の阻害、変性を促し28)、Bは主にエンドトキシン分子に作用し、凝集体あるいはミセルの構造変化を引き起こします29) 30)。
  その結果、反応阻害もしくは促進の原因となります。

  掲載日：2019/4/1

• Q2-6比色法組換え試薬（パイロスマートネクストジェン）は、従来のライセート試薬と同等の感度、精度、特異性を示しますか？

  A2-6

  当社のパイロスマートネクストジェンは、カブトガニの血球抽出成分（ライセート）の構成因子であるC因子、B因子および凝固酵素前駆体の3つの組換えタンパク質からなるエンドトキシン比色測定試薬です。
  従来の当社ライセート試薬（エンドスペシーES-50Mセットやパイロクロム）と、測定感度、精度、特異性の面で、良好な相関性を示すことが確認されています32), 33), 。

  当社のWebinar②：PyroSmart NextGen　技術情報も参考にしてください。

  掲載日：2019/4/1

• Q2-7組換え試薬は局方エンドトキシン試験に使用できますか？

  A2-7

  日本薬局方には、エンドトキシン試験にはカブトガニ（Limulus polyphemusまたはTachypleus tridentatus）の血球抽出成分より調製されたライセート試薬を用いるとあり、組換え試薬についての記述はないことから、現時点では、組換え試薬を用いることはできません。

  米国FDAはエンドトキシン試験に関するQ&Aの中で、USP<1125>「公定書手順のバリデーション」34)に従い評価し、同等以上の結果が得られれば、組換えカブトガニC因子試薬の使用を代替法として認めるとしています1)。
  EP 5.1.10でもGeneral Noticesで定めた代替法として組換えC因子試薬を使用できるとしています5)。

  掲載日：2019/4/1

3. エンドトキシン測定装置・器具

• Q3-1ウェルリーダーの機器更新推奨期間はどのくらいですか？

  A3-1

  「一般医療機器 ウェルリーダーSK603」の耐用期間は、製造販売業者：株式会社サイニクスにより耐用期間を7年（自己認証による）に設定されています。
  耐用期間を超えたご使用では、定期的に保守点検を実施しても、製造当初の性能を維持し続けることには限界がありますので、耐用期間を目途に早めの更新をおすすめします。

  なお、「ウェルリーダーアドバンス」および「ウェルリーダーMP-96（2016年2月製造中止）」につきましても、製造元：株式会社サイニクスにより、更新推奨時期を納入後7年と設定されています。
  更新推奨時期を目途に早めの更新をご検討ください。

  詳細は当社Webサイト内でご案内しておりますので、以下よりご参照ください。

  • 一般医療機器ウェルリーダーSK603　耐用期間および修理対応についてのお知らせ
  • ウェルリーダーMP-96　更新と定期的な保守点検について

  掲載日：2019/4/1

• Q3-2エンドトキシン自動測定システムENDOMEASURETMは、どこまでの操作を自動化できる装置なのでしょうか？

  A3-2

  当社販売のENDOMEASURE^TMは、ENDOMEASUREソフトウェアに統合されたエンドトキシン全自動測定システムで、ハミルトン社製の液体ハンドリングロボットとマイクロプレートリーダーから構成され、標準エンドトキシン溶液^＊および試料溶液の希釈・分注から、ライセート試薬の溶解・添加、マイクロプレートのリーダーへの搬送、測定開始、報告書の作成までを自動で行います。

  必要な器具（プレート、チップ、試験管）や試薬（ライセート試薬、エンドトキシン試験用水）の数量も事前に表示されますので、測定操作やデータ転記に伴うヒューマンエラーを最小化できます。

  ^＊エンドトキシン標準溶液(1,000EU/mL)は、お客さまにご用意いただく必要があります。

  掲載日：2019/4/1

• Q3-3ゲル化反応用の試験管は洗浄後、再利用できますか？

  A3-3

  マルチテストのゲル化用反応試験管（製品名：Pyrotube）は、再利用することはできません。

  なお、標準溶液や試料の希釈・保存用に使用したガラス試験管は、使用後、洗浄、乾熱滅菌すれば再利用可能ですが、試料や洗剤の残存や繰り返し使用した場合のガラスの劣化の影響も考えられますので、当社販売の乾熱滅菌試験管を単回使用することをおすすめします。

  掲載日：2019/4/1

• Q3-4測定装置（ウェルリーダー、EGリーダーSV-12）のランプやフィルターの交換はどのようにすればよいですか？自分でもできますか？

  A3-4

  ランプやフィルターの交換は、ユーザーのみなさまがご自分で簡単に行っていただくことが可能です。

  交換手順、注意事項、交換前後の確認事項を記した手順書をご用意しておりますので、当社までご請求ください。

  掲載日：2019/10/1

• Q3-5測定装置（ウェルリーダー、EGリーダーSV-12）の定期校正はどのように行えばよいのでしょうか。

  A3-5

  測定装置の校正点検およびアフターメンテナンスは、当社と製造元の株式会社サイニクスで連携して実施します。

  各種サービスのお申込み窓口は当社、サービス実施は株式会社サイニクスが行います。

  校正点検の詳細のご確認やサービスのお申込みは当社Webサイトにて受け付けています。

  掲載日：2019/10/1

• Q3-6ウェルリーダーアドバンスの測定原理と特長を教えてください。

  A3-6

  ウェルリーダーアドバンスは、96穴マイクロプレートを用いて、多検体同時に比色法あるいは比濁法によるエンドトキシンを測定するための、温度制御式2波長マイクロプレートリーダーです。
  付属の専用ソフトにより、検体とライセート試薬のミキシングから、加温、吸光度測定、測定結果の算出まで自動的に行います。液体ハンドリングロボットと組み合わせることにより、エンドキシン試験の全自動化が可能です。

  掲載日：2019/10/1

• Q3-7EGリーダーSV-12の測定原理と特長を教えてください。

  A3-7

  EGリーダーSV-12は、少数検体を専用のLAL試薬エンドスペシーES-24Sセットを用いて、比色法カイネティック反応速度法でエンドトキシン測定するためのチューブリーダーです。
  付属の専用ソフトにより、インキュベーション、吸光度測定、測定結果の算出まで自動的に行います。

  Q&A 1-2もご参照ください。

  掲載日：2019/10/1

• Q3-8エンドトキシン試験でDI対応が求められています。どのように対処すればよいのですか？

  A3-8

  当社ではデータインティグリティー(DI)対応版の、ウェルリーダーアドバンス専用ソフトをご用意しています。

  詳細は当社Webサイト内でご案内しておりますので、以下よりカタログをご参照ください。

  • Software for Wellreader, DIエディション

  掲載日：2019/10/1

• Q3-9EGリーダーSV-12の機器更新推奨期間はどのくらいですか？

  A3-9

  「EGリーダーSV-12」は、製造元：株式会社サイニクスにより、更新推奨時期を納入後7年と設定されています。
  

  定期的に保守点検を実施しても、製造当初の性能を維持し続けることには限界がありますので、更新推奨時期を目途に早めの更新をご検討ください。なお、保守点検についてはQ&A 3-5をご参照ください。

  詳細は当社Webサイト内でご案内しておりますので、以下よりご参照ください。

  • 長年ご使用頂いているEGリーダーSV-12の更新と定期的な保守点検のお願い
  • EGリーダーSV-12　更新と定期的な保守点検について

  掲載日：2019/10/1