第十八改正日本薬局方：参考情報　測定試薬に遺伝子組換えタンパク質を用いる代替法：標準操作法

パイロスマートネクストジェンを用いたカイネティック比色法

予備試験

1. 検量線の信頼性確認試験

• • 1-1. エンドトキシン標準溶液の調製
    
    • エンドトキシン標準原液（10,000EU/mL）を試験管ミキサーで1分間攪拌する。
      
    • LRWを用いて10倍段階希釈を繰り返し、0.1 EU/mLを調製する。
      
    • さらに、2倍段階希釈を4回繰り返し、エンドトキシン標準溶液5濃度（0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 EU/mL）を調製する。
      • 段階希釈では各1分間試験管ミキサーで攪拌してください。
      
      
      
      
    
    
  • 1-2. 各試料のプレートへの分注
    
    • LRWおよび1-1 で調製したエンドトキシン標準溶液5濃度（0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 EU/mL）の各0.05mLずつをプレートの所定のウェルに分注する（ウェルパターン例参照）
      • 調製後のエンドトキシン標準溶液は使用直前に10秒間攪拌してください。
      • 陰性対照として同時にLRWを測定することをおすすめします。
      • 試料の分注後、ただちにプレートに蓋をかぶせてください。
        
        
        
    
    
    
  • 1-3. パイロスマートネクストジェン試薬の調製
    
    • パイロスマートネクストジェン試薬のバイアルを軽く叩いて、飛散した粉末を底に落とす。
    • ピンセットを用いて栓を無菌的に持ち上げ、真空状態を解除する。栓は廃棄する。
    • パイロスマートネクストジェン添付の溶解緩衝液2.8mLをトキシペットチップ1000で加え、バイアルの口に乾熱滅菌アルミ箔をかぶせる。
    • 手で小さな円を描くように1分間攪拌して完全に溶解させる。
      細かい泡が消失するまで少なくとも2分間放置する。
      • 使用する直前に、液が均一になるようにバイアルを振り混ぜます。
        ただし、泡立てると感度低下を招くことがありますので、激しい撹拌は避けてください。
      • 溶解後、20分以内に速やかに使用してください。
        
        
        
        
    
    
    
  • 1-4. パイロスマートネクストジェンの添加および測定
    
    • 完全に溶解したパイロスマートネクストジェン 0.05mLをシリンジで所定のウェルに添加する。
    • プレートに蓋をかぶせ、ウェルリーダーアドバンスにセットする。
    • [測定]ボタンをクリックすると、直ちに1分間攪拌され、あらかじめ設定した測定条件で自動的に測定が開始される。
      
      
      
      
    
    
    
  • 1-5. データ解析
    
    • 測定終了後、ファイルは自動的に保存される。
      • Software for Wellreader, DIエディションであらかじめ設定した解析条件で、自動解析されます。
    
    
  • 1-6. 判定
    
    • [検量線の表示]ボタン－[検量線の情報]ボタンをクリックし、作成した検量線の相関係数 r を求め、その絶対値｜r｜が0.980以上であることを確認する。