第十八改正日本薬局方：参考情報　測定試薬に遺伝子組換えタンパク質を用いる代替法：標準操作法

パイロスマートネクストジェンを用いたカイネティック比色法

予備試験

2. 反応干渉因子試験

• • 2-1. エンドトキシン標準溶液の調製
    
    • 1. 検量線の信頼性確認試験：1-1. エンドトキシン標準溶液の調製に従い、エンドトキシン標準溶液 5濃度（0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 EU/mL ）を調製する。
    
    
  • 2-2. 2倍濃度試料溶液の調製
    
    • 例：10倍希釈試料溶液を測定に用いる場合は、試料原液を5倍希釈します。
    • 試験管にLRW 0.4mLを入れる。
    • 被検試料原液は試験管ミキサーで渦ができるよう1分間攪拌後、0.1ｍLを（1）の試験管に加え、試験管ミキサーで1分間攪拌し、2倍濃度試料溶液とする。
      
      
      
      
    
    
  • 2-3. 試料添加用エンドトキシン標準溶液の調製
    
    • 検量線の中点濃度（または中点付近濃度）のエンドトキシンの2倍濃度溶液を調製します。
      検量線用に調製したエンドトキシン標準溶液のうち、0.1EU/mLエンドトキシン標準溶液を試料添加用エンドトキシン標準溶液として使用します。
    
    
  • 2-4. 各試料のプレートへの分注
    
    • A, B, CおよびD液をマイクロプレート上で調製します。
    • LRW（D液）および2-1で調製したエンドトキシン標準溶液5濃度（C液：0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 EU/mL）の各0.05mLずつをプレートの所定のウェルに分注する（ウェルパターン例参照）。
    • A液：所定のウェル（T1）にLRWを0.025mLずつ分注する。
    • B液：所定のウェル（Tr1）に 2-3 で調製した0.1EU/mL試料添加用エンドトキシン標準溶液を0.025mLずつ分注する。
    • A, B液：2-2 で調製した2倍濃度試料溶液を所定のウェル（T1、Tr1）に0.025mLずつ分注する。
    • 必要に応じて、プレートミキサーで1分間攪拌する。
      • 調製後のエンドトキシン標準溶液は使用直前に10秒間攪拌してください。
      • 試料の分注後、ただちにプレートに蓋をかぶせてください。
    
    
    • 
      
      
    • ※ 試料溶液原液で測定する場合
      • その原液に中点濃度（または中点付近濃度）になるようにエンドトキシンを添加しますが、あらかじめ試験管内で、中点濃度の100倍濃度のエンドトキシン標準溶液を試料溶液原液で10倍希釈を2回行うなどして調製します。それを所定のB液のウェルに0.05mL分注し、試料溶液原液を所定のA液のウェルに0.05mL分注します。
    
    
  • 2-5. パイロスマートネクストジェン試薬の調製
    
    • 1. 検量線の信頼性確認試験：1-3 パイロスマートネクストジェン試薬の調製に従い、パイロスマートネクストジェンを調製する。
    
    
  • 2-6. パイロスマートネクストジェンの添加および測定
    
    • 完全に溶解したパイロスマートネクストジェン 0.05mLをシリンジで所定のウェルに添加する。
    • プレートに蓋をかぶせ、ウェルリーダーアドバンスにセットする。
    • [測定]ボタンをクリックすると、直ちに1分間撹拌され、あらかじめ設定した測定条件で自動的に測定が開始される。
    
    
  • 2-7. データ解析
    
    • 測定終了後、ファイルは自動的に保存される。
      • Software for Wellreader, DIエディションであらかじめ設定した解析条件で、自動解析されます。
    
    
  • 2-8. 判定
    
    • 試験の有効性を確認する。
      
      
      以下の2つの条件に適合するとき、反応干渉因子試験は有効である。
      

      • C液：作成した検量線の相関係数 r を求め、その絶対値｜r｜が0.980以上である。
      • D液：パイロスマートネクストジェンに設定されている空試験の限度値を超えない。
        （本操作法：反応速度法における限度値は吸光度変化率1.0mAbs/minである）
      
      ①[検量線の表示]ボタン－[検量線の情報]ボタンをクリックし、相関係数 r を確認する。
      ②[計算結果]ボタンをクリックし、D液の吸光度変化率が1.0mAbs/minを超えないことを確認する。
      
      
    • エンドトキシン回収率を算出し、試験の判定を行う。
      ①B液で測定されたエンドトキシン濃度とA液で測定されたエンドトキシン濃度の差に基づいて、B液の添加エンドトキシン濃度に対するエンドトキシンの回収率を計算する。
      
      
      
      
      ②添加エンドトキシンの回収率が50～200%の範囲にあるとき、反応干渉因子は試料溶液に存在しないと判定する （回収率が50～200%の範囲にあるとき「適合」）。